Achmad Farajallah

R Ajeng Siti Fatimah, Achmad Farajallah, Arif Wibowo. 2011. Karakterisasi Genom Mitokondria Gen Cyt b pada Ikan Belida Anggota Famili Notopteridae. Diseminarkan tanggal 7 Januari 2011. Departemen Biologi FMIPA IPB.

 

 

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ikan belida merupakan ikan air tawar yang tergolong dalam famili Notopteridae, genus Chitala dengan daerah persebaran meliputi India, Pakistan, Bangladesh, Srilanka, Nepal, Thailand dan Indonesia (Jawa, Sumatera dan Kalimantan). Ikan belida memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena dagingnya yang enak selain itu memiliki pola sisik yang unik sehingga dimanfaatkan untuk ikan hias, di Sumatera Selatan digunakan sebagai maskot dan pembuatan makanan khas lokal (Madang 1999). Studi mengenai ikan air tawar memiliki aspek penting dalam biogeografi, karena persebarannya di laut (saltwater areas) yang tidak mudah dan garis evolusinya yang berkaitan erat dengan sejarah geologis (Inoue et al. 2009; Lundberg 1993)

Secara umum populasi Chitala sp. di seluruh dunia terus menurun. Penurunan populasi terutama diakibatkan kerusakan habitat dan penangkapan langsung dari alam. Oleh karena itu, Conservation Assessment and Management Plan (CAMP) mengkategorikan Chitala sp. sebagai spesies langka (Sarkar et al. 2008). Pemerintah juga mengeluarkan SK Mentan No.716/Kpts/UM/ 10/1980 dan PP 7/1999 yang menyatakan bahwa semua jenis ikan dari genus Chitala merupakan ikan yang dilindungi. Salah satu upaya untuk melestarikan ikan belida ialah dengan mengumpulkan informasi sebanyak-banyaknya baik informasi morfologi maupun genetik. Informasi genetik antara lain didapatkan dengan melakukan karakterisasi genom mitokondria sebagai dasar aplikasi lanjutan yang terkait dengan populasi belida.

Genom mitokondria hewan merupakan genom yang diwariskan secara maternal dan tidak mengalami rekombinasi. Dengan begitu, keragaman yang ditemukan pada genom mitokondria disebabkan oleh kejadian mutasi. Genom mitokondria tidak memiliki intron dan terdiri dari coding region dan non coding-region. Coding region terdiri  atas 2  gen penyandi  rRNA, 22  tRNA, dan 13 protein, sedangkan non coding-region merupakan satu ruas yang diduga berfungsi sebagai pengontrol transkripsi yang dikenal sebagai d-loop (Anderson et al. 1981; Avise JC 1994). Genom mitokondria sangat populer dijadikan sebagai penanda molekular untuk mempelajari berbagai fenomena populasi hewan, baik analisis intraspesies maupun interspesies (Moritz et al. 1987).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi runutan nukleotida genom mitokondria gen cyt b pada ikan belida anggota famili Notopteridae yang ada di sungai Kampar sebagai dasar mempelajari populasi dan posisi filogenetiknya.

BAHAN DAN METODE

Bahan

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 12 sampel darah ikan belida yang diambil dari Sungai Kampar, Riau pada lima titik berbeda. Masing-masing titik berjarak antara 50-150 km. Sebanyak tiga sampel (WD22, WD23 dan WD24) berasal dari sungai Kampar kanan, Waduk Kuto Panjang, satu sampel (ST03) dari Sungai Teso, tiga sampel (GG03, GG04 dan GG06) dari Langgam, dua sampel (KT10 dan KT20) dari Kuala Tolam tiga sampel (RB08, RB09 dan RB11) dari Rantau Baru. Semua sampel yang digunakan merupakan koleksi Arif Wibowo SP. M.Si dari Balai Riset Perikanan (BRP), Palembang.

Ekstraksi dan Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA mini kit for blood (Geneaid) yang dimodifikasi. Sel-sel darah ikan belida yang disimpan dalam alkohol 70% dicuci dengan air destilata dua kali kemudian disuspensikan dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8) hingga volume 350µl. Sel-sel darah dilisis dengan SDS 1% dan proteinase K 0.125 mg/ml pada suhu 55^oC selama 1 jam sambil dikocok pelan. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNA mini kit for fresh blood (Geneaid).

Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA

Amplifikasi gen cyt b genom mitokondria menggunakan primer forward W8  dan reverse W7  berdasarkan (Lavoue dan Sullivana (2004) yang mengapit ruas gen cyt b. Pasangan primer ini mengapit ruas gen cyt b mulai dari basa ke-14359 hingga 15594 dengan panjang 1236 nt.

Komposisi reaksi PCR dilakukan dengan volume akhir 50 µl terdiri atas sampel DNA 5 µl, DW steril 16 µl, primer masing-masing 2 µl dan Taq ready mix 25 µl. Reaksi PCR dilakukan menggunakan mesin thermocycler BIOER dengan kondisi sebagai berikut: tahap pradenaturasi 95°C selama 10 menit, tahap kedua yang terdiri dari 35 siklus yang masing-masing mencakup tahap denaturasi 94°C selama satu menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 42°C selama satu menit, pemanjangan (extension) pada suhu 72 °C selama 1,5 menit dan tahap terakhir yaitu pemanjangan akhir (final extension) pada suhu 72 °C selama 7 menit. Produk PCR diuji menggunakan PAGE 6% dalam bufer 1x TBE  (10 Mm Tris-HCL, 1 M asam borat, dan EDTA 0.1 Mm) yang dijalankan pada kondisi 200 Mv selama 30 menit. Selanjutnya DNA diwarnai dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstrom 1986).

 

Tabel 1. Tujuh spesies anggota Notopteridae di GeneBank

No.	No. Akses	Spesies	No.	No. Akses	Spesies
1	AP008921	Chitala blanci	5	AP008925	Notopterus notopterus (Thai.)
2	AP008922	Chitala lopis	6	AP008926	Papyrocranus congoensis
3	AP008923	Chitala ornate	7	AP008927	Xenomystus nigri
4	AP008924	Notopterus notopterus (India)

 

 

 

 

 

Perunutan Produk PCR

Produk PCR di atas gel poliakrilamid yang berukuran sesuai dengan desain primer dimurnikan dengan metode agarose-gel-cutting yang diikuti dengan spin-coloumn DNA extraction from gel. Produk PCR yang sudah dimurnikan dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing dengan menggunakan pasangan primer yang sama dengan ampilfikasi awal.

Analisis DNA

Hasil perunutan nukleotida diedit secara manual berdasarkan kromatogram. Runutan nukleotida yang sudah diedit kemudian saling disejajarkan dengan melibatkan beberapa runutan gen cyt b anggota famili Notopteridae (Tabel 1) menggunakan Clustal W yang tertanam dalam MEGA 4.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (Kumar et al. 2008). Deskripsi perbandingan runutan nukelotida dan analisis filogeni Neighbor Joining (NJ) dilakukan menggunakan MEGA 4.0 berdasarkan model substitusi Kimura-2-paramater dengan bootstrap 1000x.

 

 

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA

Amplifikasi gen cyt b berhasil pada tujuh sampel (WD23, WD24, RB08, RB09, RB11, GG04 dan GG06) menggunakan primer W8 dan W7 menunjukkan fragmen DNA multiband (Gambar 1). Pita DNA dengan ukuran yang sesuai target dipotong setelah dipisahkan menggunakan metode gel extraction-spin coloumn.

 

Gambar 1. Produk PCR hasil running menggunakan PAGE 6%.  Kolom 1: RB 08, 2.RB09, 3.RB11,4.WD23, 5. WD24, 6.GG04, 7.GG06,

Perunutan DNA

Keseluruhan sampel yang berhasil diamplifikasi berasal dari tiga lokasi yaitu Langgam (GG), Rantau Baru (RB) dan Waduk Kuto Panjang (WD) yang terdiri atas tujuh sampel yaitu RB08, RB09, RB11, GG04, GG06, WD23 dan WD24 menunjukkan homologi yang tinggi dengan spesies pembanding. Setelah diedit, panjang setiap sampel adalah 1047 nt dan rata-rata komposisi nukleotida dari tujuh sampel tersebut ialah A= 29.2% ; T= 26.3% ; G= 13.8 % dan C= 30.7%. Dari 1047 nt, sebanyak 1017 nt sama pada semua sampel. Sedangkan dari 30 nt berbeda yang terdiri dari 1 nt mengalami insersi/delesi dan 24 nt mengalami substitusi hanya pada satu sampel. Sebanyak 5 nt berbeda minimal pada dua sampel. Laju insersi/delesi rendah pada coding region berbeda pada non-coding region yang memiliki laju insersi/delesinya lebih tinggi (Kumar S dan Nei M. 2000).

Analisis Filogeni

Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode Kimura-2-parameter yaitu metode yang menggunakan parameter transisi dan transversi untuk menghitung persentase besarnya perbedaan jarak genetik antar sampel. Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000x dan menggunakan data berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) serta asam amino (b) dari tujuh sampel dan tujuh spesies pembanding. Substitusi sinonim seringkali terjadi di basa ke-1 dan ke-3 setiap kodon, sedangkan substitusi nonsinonim sering terjadi di basa ke-2 (Kumar S dan Nei M 2000). Topografi keduanya menunjukkan bahwa ketujuh sampel dan Chitala lopis berada pada klade yang sama di kelompok 1. Jarak evolusi pada sampel WD 23 lebih besar dibandingkan dengan sampel lainnya.

Gambar 2. Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokan tujuh sampel dan tujuh spesies pembanding berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) dan asam amino (b) pada ruas gen cyt b mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000x

Secara geografis, distribusi Notopteridae dibagi menjadi dua yaitu, Notopteridae Afrika dan Notopteridae Asia. Kelompok 3 termasuk dalam Notopteridae Afrika sedangkan kelompok 1 dan 2 termasuk dalam Notopteridae Asia (Roberts 1992). Notopteridae Afrika lebih berpotensial untuk bermigrasi ke Asia yang dijelaskan ke dalam beberapa model distribusi (Inoue et al. 2009).

Jika runutan nukleotida pembanding ikut dianalisis, rasio transisi terhadap transversi yang terkecil yaitu 0 ditemukan antara RB09 dengan RB11, sedangkan yang terbesar yaitu 9.3 ditemukan antara C. ornata dengan GG06. Persentase rasio yang bernilai ≤ 1 adalah 38.5% sedangkan persentase rasio yang bernilai >1 adalah 61.5%. Pada gen cyt b, laju transisi lebih besar daripada laju transversi. Jarak genetik merupakan nilai kekerabatan yang diukur dari jumlah mutasi nukleotida dan dianalisis berdasarkan dua basa pertama setiap kodon. Sampel RB09 dan RB11 tidak memiliki jarak genetik, sedangkan jarak terbesar ditemukan antara spesies pembanding Papyrocranus dan WD23 sebesar 0.102 dengan 232  nt yang berbeda.

Waduk Kuto Panjang berada di bagian hulu Sungai Kampar sedangkan Langgam dan Rantau Baru relatif berada di antara hulu dan hilir. Semakin ke hilir, badan sungai dan volume air semakin besar karena adanya tambahan air dari anak sungai lainnya yang akan bermuara ke Selat Malaka. Semakin panjang dan lebar ukuran sungai maka keragaman ikannya akan semakin tinggi (Kottelat et al. 1996). Keragaman berkaitan dengan kekerabatan suatu populasi dan dapat dilihat dari jarak genetiknya. Rata-rata jarak genetik antara populasi Langgam dengan Rantau Baru dan Waduk Kuto Panjang berturut-turut adalah 0.003 dan 0.016, sedangkan antara Rantau Baru dengan Waduk Kuto Panjang adalah 0.014. Rata-rata jarak genetik intrapopulasi Langgam, Rantau Baru dan Waduk Kuto Panjang berturut adalah 0.004, 0.003 dan 0.023. Rata-rata keragaman seluruh populasi sampel berdasarkan dua basa pertama setiap kodon adalah 0.01.

 

SIMPULAN DAN SARAN

Gen cyt b mtDNA pada tujuh sampel yang berasal dari sungai Kampar, Riau berada dalam kelompok yang sama dengan gen cyt b mtDNA dari Chitala lopis. Berdasarkan rasio transisi/transversi antar sampel dan spesies pembanding jenis mutasi substitusi transisi lebih sering terjadi daripada transversi. Kekerabatan interpopulasi yang terdekat ialah antara Langgam dengan Rantau Baru sedangkan kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi Rantau Baru. Penelitian ini memerlukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan ruas gen selain cyt b pada mtDNA dan pengambilan sampel dari berbagai populasi dan lokasi yang berbeda di Indonesia untuk membuktikan kekerabatan antara sampel dengan C.lopis

 

DAFTAR PUSTAKA

Anderson S et al. 1981. Sequence and Organization of the Human Mitochondrial Genome. Nature 290:457-74.

Avise JC. 1994. Moleculars Marker, Natural History and Evolution. New York: Chapman&Hall.

Inoue JG, Kumazawa Y, Miya M ,Nishida M. 2009. The Historical Biogeography of the Freshwater

Knifefishes Using Mitogenomic Approaches: A Mesozoic Origin of the Asian Notopterids (Actinopterygii: Osteoglossomorpha). Mol Phyl and Evol 51:486–499.

Kottelat M, Whitten JA, Wirjoatmodjo S, Kartikasari SN. 1996. Freshwater Fishes of Western Indonesia and Sulawesi. Jakarta: Periplus Edition Ltd.

Kumar S, Nei M. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press.

Kumar S, Dudley J, Nei M, Tamura K. 2008. MEGA: A Biologist-Centric Software for

Evolutionary Analysis of DNA and Protein Sequences. Brief in Bioin 9: 299-306.

Lavoue´ S, Sullivana JP. 2004. Simultaneous Analysis of Five Molecular Markers Provides a Well-Supported Phylogenetic Hypothesis for the Living Bony-Tongue Fishes (Osteoglossomorpha: Teleostei). Mol Phyl and Evol 33:171–185.

Lundberg JG. 1993. African-South American Freshwater Fish Clades and Continental Drift: Problems with Paradigm. Di dalam: Goldblatt P, editor. Biological relationship between Africa and South America. New Haven: Yale University Press. hlm 156-159.

Madang K. 1999. Morfologi Habitat dan Keragaman Genetik Kerabat Ikan Belida Di Perairan Sumatera Selatan [disertasi].Bogor: Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.

Moritz C, Dowling TE, Brown WM. 1987. Evolution of Animal Mitochondrial DNA: Relevance for Population Biology and Systematic. Ann Rev Ecol Syst 18:269-291.

Roberts TR. 1992. Systematic Revision of the Old World Freshwater Fish Family Notopteridae. Ichthyol Explor Freshwater 2:361-383.

Sarkar UK, Negi RS, Deepak PK, LakraWS, Paul SK. 2008. Biological Parameters of the Endangered Fish Chitala chitala (Osteoglossiformes: Notopteridae) from some Indian Rivers. Fisheries Research 90:170–177.

Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in Natural Populations: an Improved Routine for the

Screening of Genetic Variation Based on Sensitive Silver Staining. Electrophoresis 7:226-229.