Seminar Dewinta G34063443

Dewinta, Achmad Farajallah, dan Yusli Wardiatno. 2010. Pola Distribusi Geografis pada Udang Mantis di Pantai Jawa Berdasarkan Genom Mitokondria. Seminar disampaikan tanggal 11 September 2010, Departemen Biologi FMIPA IPB.

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Udang mantis atau udang ronggeng merupakan anggota Filum Arthropoda, Subfilum Crustacea, Ordo Stomatopoda, yang terdiri atas empat famili, yaitu Odontodactylidae, Lysiosquillidae, Harpiosquillidae dan Squilidae. Sebagaimana udang  pada umumnya, kelompok udang ini dicirikan dengan  tubuh yang bersegmen, di belakang kepala terdapat karapas pendek, kaki  beruas-ruas, ukuran tubuh yang besar dan mata seringkali berbentuk T (Carpenter dan Niem 1998).

Habitat sebagian besar udang mantis adalah pantai, senang hidup di dasar air terutama  pasir berlumpur. Cara hidup udang mantis dengan menggali dan bersembunyi di dasar air untuk berburu mangsa. Salah satu udang mantis yang bernilai ekonomi tinggi adalah Harpiosquilla harpax dari Famili Harpiosquillidae. Udang ini diekploitasi untuk diperdagangkan sebagai makanan eksotik. Jenis udang mantis lain yang sering diperdagangkan adalah Lysiosquillina  maculata, Squilla empusa, dan S.mantis (Moosa 1997).

Karakteristik dari stomatopoda sebagai hewan pemangsa memiliki dua metode untuk menangkap mangsa. Kedua metode inilah yang kemudian akan membedakan kelompok fungsional stomatopoda yang sangat luas,  yaitu smashers (galak) dan spearers (sangat baik). H. Harpax sendiri tergolong kedalam spearers (Ahyong 1997).

H. harpax banyak ditemukan di Pantai Utara Pulau Jawa, Selat Malaka sampai ke Laut Pasifik (Ahyong et al. 2008). Ciri-ciri H. harpax adalah tubuh terdiri atas tiga bagian yaitu kepala, thoraks dan abdomen, karapas dengan median carina, distal segmen dari uropod memiliki garis tengah warna putih atau sedikit hitam, carina intermediat  tidak terlalu tajam, rostal dilengkapi dengan projeksi anterior, panjang total mencapai 30 cm, mata sangat besar dan berbentuk T, telson berduri dan median carina pada telson memiliki dua bintik hitam (Carpenter dan Niem 1998).

Udang betina mampu menelurkan 50.000 hingga 1 juta telur, yang akan menetas setelah 24 jam menjadi larva nauplius (Choi dan Hong 2001). Tahap perkembangan larva pada udang  mantis terdiri dari empat fase. Fase pertama yaitu  nauplius, larva nauplius tidak dapat berenang sehingga terbawa arus kemana saja arus bergerak, terutama arus sejajar garis pantai, bermetamorfosis dalam enam  stages berkisar selama dua hari. Fase ke dua yaitu  protozoea, mempunyai tujuh  pasang anggota tubuh, bermetamorfosis dalam  tiga stages berkisar selama tujuh hari. Fase ketiga yaitu mysis bermetamorfosis dalam  tiga stages berkisar selama tujuh hari.  Fase terakhir yaitu  postlarva, pada fase ini udang mulai memiliki karakteristik udang dewasa, dilanjuti  menjadi  juvenil dan   udang dewasa (Choi, 2001).

Pergerakkan arus ini  bergantung kepada arah/sudut gelombang yang datang. Pada kawasan pantai yang diterjang gelombang menyudut, terhadap garis pantai, arus yang dominan terjadi adalah arus sejajar pantai. Pergerakan arus sejajar dengan garis pantai inilah yang menyebabkan pola penyebaran terus mengikuti garis pantai. Persebaran larva yang hanyut terikut arus terus mengalami persebaran yang sangat luas  bahkan antar samudera (Barber et al. 2002).

Dalam penelitian ini populasi H. harpax berusaha dipelajari menggunakan penanda genetik genom mitokondria, yaitu ruas genom yang dikenal dengan d-loop atau control region. Genom mitokondria hewan merupakan genom sitoplasmik yang diwariskan secara uniparental, dan tidak mengalami rekombinasi. Genom mitokondria atau mtDNA terdiri  atas 2  gen penyandi  rRNA, 22  tRNA, dan 13 gen penyadi protein yang terlibat dalam rangkaian rantai  respirasi selular, dan satu ruas yang berfungsi sebagai pengontrol transkripsi yang dikenal sebagai d-loop. Ruas d-loop dikenal mempunyai laju mutasi yang lebih cepat dibanding ruas-ruas gen lainnya, sehingga sangat cocok untuk digunakan sebagai penanda genetik untuk mempelajari fenomena intraspesifik (Cook 2005).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman genetik udang mantis Harpiosquilla harpax di Pantai Jawa, berdasarkan genom mitokondria.

BAHAN DAN METODE

Metode

Koleksi Udang dan Identifikasi sampel. Udang mantis H. harpax sebanyak delapan ekor koleksi bapak Dr. Yusli Wardiatno dari Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan IPB yang dipreservasi dalam etanol. Kepastian spesies udang mantis sebagai Harpiosquilla harpax diidentifikasi berdasarkan kunci identifikasi (Carpenter dan Niem 1998).

Ekstraksi dan Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan dari otot tungkai. Otot tungkai yang disimpan dalam etanol dicuci dengan air destilata dua kali kemudian dihomogenasi dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8). Sel-sel otot dilisis menggunakan proteinase K 0,125 mg/ml dan sodium dodesil sulfat 1%. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNA mini kit for fresh blood.

Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA. Bagian d-loop dari mtDNA diamplifikasi menggunakan primer yang didesain menggunakan Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) dengan referensi beberapa mtDNA anggota stomatopoda yang ada di Gen Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov).  Primer  forward AF180berada pada urutan 15102 nt dan primer reverse AF181 berada pada urutan 15127 terhadap mtDNA H.harpax, dengan target DNA hasil amplifikasi berukuran 929 bp.

Reaksi PCR dilakukan dalam volume 50 μL.  Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan 30 siklus yang terdiri atas denaturasi suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer suhu 54oC selama 1 menit, pemanjangan 72oC selama 2.30 menit dan diakhiri pemanjangan akhir suhu 72oC selama 7 menit. Produk PCR diuji menggunakan PAGE 6%, kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstrom 1986).

Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequencing. Produk  PCR berupa pita tunggal di atas gel poliakrilamid dan berukuran sesuai desain primer dimurnikan, untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. PCR untuk sequencing menggunakan primer yang sama seperti amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh kemudian diedit secara manual. Runutan-runutan nukleotida yang telah diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi, yaitu H. harpax yang ditangkap dari Pantai Vietnam dengan No akses AY699271 (Miller dan Austin 2006) menggunakan program Clustal W 1.8 yang tertanam dalam program  MEGA versi 4.00.

Analisis Filogeni. Analisis keragaman nukleotida dan filogenetik dilakukan menggunakan MEGA (Kumar et al. 2008) berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter. Analisis kekerabatan antar sampel menggunakan metode neighbour joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Identifikasi

Hasil  identifikasi berdasarkan buku identifikasi Carpenter dan Niem (1998) menunjukkan bahwa sampel udang yang digunakan adalah spesies  H. harpax.

 

Amplifikasi dan Visualisasi DNA

Dari kedelapan sampel yang digunakan, semuanya berhasil diamplifikasi. Amplifikasi menggunakan pasangan primer AF180 dan AF181 menghasilkan pita tunggal berukuran sekitar 1100bp (Gambar 1).

Gambar 1. Produk PCR berupa pita tunggal yang diuji dengan menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6%. Keterangan: M = DNA marker 100 bp, No urut sesuai dengan Gambar 2.

Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA SequencingPanjang basa nukleotida DNA setelah ruas penempelan primer dibuang dan diedit, yakni sekitar 800-an. Setelah disejajarkan, runutan nukleotida yang bisa dilanjutkan dianalisis berada pada posisi 13496 nt sampai 14273 nt berdasarkan referensi mtDNA H. harpax (Miller dan Austin 2006) sepanjang 787 nt. Dari 787 nukleotida, sebanyak 645 nt sama untuk semua sampel. Dari 142 nt yang berbeda, sebanyak 9 nt merupakan insersi/delesi yang hanya ditemukan pada  satu sampel dan 84 nt substitusi yang hanya ditemukan pada satu sampel sehingga sebanyak 93 nt tidak diikutkan dalam analisis berikutnya karena tidak bersifat parsimoni. Sisanya sebanyak 49 nt yang terdiri dari dua jenis mutasi, yaitu subsitusi dan insersi/delesi kemudian digunakan dalam menghitung keragaman genetik (Gambar 2).

Gambar 2. Runutan nukleotida yang saling berbeda antar sampel yang digunakan dalam analisis keragaman genetik dan membangun pohon filogeni. Nomor urut nuleotida ditulis secara vertikal (5 baris paling atas)  mengacu pada genom mitokondria H. harpax No. akses AY699271.

Secara filogeografi H. harpax di Perairan Cirebon terpisah dengan H. harpax di Perairan Vietnam. Hal ini dibuktikkan oleh nilai jarak genetik terjauh adalah antara H. harpax Vietnam dan H. harpax 3 yaitu sebesar 10,5%, sedangkan jarak genetik paling dekat adalah antara H. harpax 1dan 6 (kelompok 1)  yaitu sebesar 1,8%. Keragaman genetik  H.harpax di Perairan Cirebon berdasarkan ruas d-loop memiliki nilai lebih besar yaitu 5.1% (±0,005) (Tabel 1) bila dibandingkan dengan keragaman genetik Halocyprida sp berdasarkan ruas C01 yaitu sebesar 2,27%. Nilai keragaman genetik d-loop yang lebih besar membuktikkan bahwa ruas ­d-loop memiliki laju mutasi lebih tinggi dibandingkan ruas-ruas pada mtDNA lainnya dan mutasi yang tinggi berbanding lurus dengan tingginya keragaman (Cook 2005).

Rata-rata komposisi nukleotida A=41,2% ; T=38,7% ; G=7,9% ; C=12,3%. Persentase A+T (79,9%) lebih besar daripada C+G (20,2%). Banyaknya basa A+T pada genom mitokondria d-loop dibandingkan C+T berkaitan dengan d-loop sebagai promotor titik awal transkripsi bagi utas berat maupun utas ringan (Hoelzoel et al. 1994). Hal lain yang menyebabkan basa AT lebih tinggi disebakan oleh adanya sekuens yang berulang dan panjangnya urutan T (Cook 2005).

Analisis Filogeni

Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootstrap1000x mengelompokkan udang H. Harpax dalam satu percabangan dan H. Harpax Vietnam berada di luar percabangan. Struktur populasi yang digambarkan oleh mtDNA ini setidaknya membagi  populasi H. harpax di perairan Cirebon menjadi dua yaitu kelompok 1 dan kelompok 2. H. harpax 1,4,6 dan 10 termasuk ke dalam kelompok 1 dan saling berkerabat dekat.

H. harpax 2, 3, 5, dan 8 termasuk ke dalam kelompok 2 dan  saling berkerabat dekat. Titik nenek moyang (anchestral node) menunjukkan bahwa kekerabatan H. harpax 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 dan 10 adalah berasal dari satu nenek moyang/indukkan. Sedangkan populasi H harpax dari perairan Cirebon berbeda nenek moyang/indukan dengan H. harpax di perairan Vietnam (Gambar 3). Hal ini disebabkan oleh pola penyebaran udang mantis sangat berkaitan erat dengan arus laut. Arus pada Laut Jawa bergerak ke arah Kalimantan sedangkan arus dari Laut China Selatan bergerak ke Vietnam sehingga pergerakan arus dari Cirebon dan Vietnam tidak searah. Penyebaran udang mantis melalui tingkat larva yang terbawa arus dan bergerak  mengikuti garis pantai. Teluk Vietnam yang berada di sisi utara dari Laut China Selatan  tidak terhubung/ saling terpisah dengan Laut Jawa (Cirebon), sehingga memiliki garis pantai yang tidak berhubungan (McCleave et al.1984).

Hal lain yang menyebabkan H. harpax di Perairan Cirebon berbeda nenek moyang/indukkan dengan H. harpax dari Perairan Vietnam adalah arus dari  Indo-Pasifik saling berhubungan karena arus yang datang dari Pasifik menuju lautan Indonesia yang juga melewati Vietnam bergerak bolak-balik, hanya saja dikarenakan adanya bencana alam yang pernah terjadi menyebabkan pola penyebaran H. harpax hanya berkisar ±40km, sehingga menyebabkan keragamannya homogen dan pola penyebaran yang terbatas/tidak luas (Barber et al. 2002).

Dari data yang ada, kelompok 1 dan 2 mungkin sebagai spesies yang berbeda dalam genus Harpiosquilla . Hal ini diperkuat dengan adanya beberapa perbedaan yaitu seperti intermediat carina pada bagian thoraks tanpa/ dilengkapi dengan duri, dari segi warna ada yang lebih gelap dan terang, dan segmen distal pada uropod ada yang tidak/ bewarna sedikit hitam (data tidak diperlihatkan). Hal ini juga disebabkan oleh spesies H. harpax yang tertangkap di Perairan Cirebon seringkali tertangkap bersamaan dengan H. raphidae.

Gambar 3. Hasil rekontruksi pohon filogeografi pengelompokan sampel H. harpax berdasarkan ruas d-loop mtDNA  menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x.

 

Tabel 1.Jarak genetik antar sampel (di bawah diagonal) dan standar error (di atas diagonal) berdasarkan model subtitusi K2P dengan bootstrap 1000x.

No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 H. harpax 1 0.010 0.011 0.006 0.010 0.005 0.009 0.008 0.011
2 H. harpax 2 0.061 0.007 0.009 0.005 0.009 0.005 0.010 0.011
3 H. harpax 3 0.080 0.041 0.010 0.007 0.010 0.007 0.011 0.012
4 H. harpax 4 0.028 0.059 0.074 0.009 0.006 0.009 0.007 0.011
5 H. harpax 5 0.064 0.023 0.047 0.059 0.009 0.005 0.010 0.011
6 H. harpax 6 0.018 0.056 0.071 0.025 0.059 0.009 0.007 0.011
7 H. harpax 8 0.059 0.018 0.040 0.056 0.020 0.056 0.010 0.011
8 H. harpax 10 0.045 0.070 0.087 0.038 0.070 0.042 0.067 0.011
9 H. harpax Vietnam 0.085 0.089 0.105 0.079 0.088 0.079 0.091 0.083

 

SIMPULAN dan SARAN

Keragaman genetik H. harpax di Perairan Cirebon berdasarkan ruas d-loop mtDNA adalah 5,1% (±0,005). Populasi H. harpax di Perairan Cirebon setidaknya bisa dibagi menjadi 2 kelompok. Populasi H. harpax di Laut Jawa jauh kemungkinannya berasal dari Perairan Vietnam. Hubungan filogeni berdasarkan ruas d-loop mtDNA  menempatkan H. harpax Cirebon berbeda nenek moyang/indukan dengan H. harpax dari Vietnam.

Saran bagi penelitian ini adalah diperlukan penelitian lebih lanjut mengunakan ruas mitokondria yang berbeda atau selain d-loop dan perlu analisis pembanding sampel H. harpax dari Pantai Utara Kalimantan dan daerah sekitar Selat Malaka untuk membuktikkan hubungan kekerabatan antara H. harpax dari Cirebon dan H. harpax dari Vietnam.

 

DAFTAR PUSTAKA

Ahyong ST, Chan TY, dan Liao YC. 2008. A Catalogue of Mantis Shrimps (Stomatopoda) of Taiwan. National Taiwan Ocean University: Keelung.

Ahyong ST. 1997. Philogenetic Analysis of the Stomatopoda (Malacostraca). Journal of Crustaceans Biology 17(4): 695-715.

Al Rozi, F. 2008. Penerapan Budidaya Udang Rama dan Berkelanjutan Melalui Aplikasi Bakteri Antagonis untuk Biokontrol Vibriosis Udang Windu (Penaeus monodon) [skripsi]. Yogyakarta: Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada.

Barber P, Moosa MK, dan Palumbi SR. 2002. Rapid Recovery of Genetics Diversity of Stomatopod Populations on Krakatau: Temporal and Spatial Scales of Marine Larval Dispersal. Journal of The Royal Society 269: 1591-1597.

Carpenter KE dan Niem VH. 1998. The Living Marine Resources of The Western Central Pacific Volume 2: Cephalopods, Crustacean, Holothurians and Shark. Food and Agriculture Organization of The United Nation: Rome.

Choi HJ dan Hong SY. 2001. Larval development of the kishi velvet shrimp, metapenaeopsis dalei (rathbun) (decapoda: penaeidae), reared in the laboratory. Fish Bull 99: 275-291.

Cook C. 2005. The Complete Mitochondrial Genome of Stomatopod Crustacean Squilla mantis. Journal of BMC Genomics 6: 1-9.

Hoelzoel AR, Lopez JV, Dover GA, Brien JO. 1994. Rapid evolution of a heteroplasmic repetitive sequences in the mitochondrial DNA control region of carnivores. J Mol Evol 39:191-199.

McCleave JD, Arnold GP, Dodson JJ, Neil WH. 1984. Mechanism of Migration in Fishesh. Plneum Press: New York dan London.

Miller AD dan Austin CM. 2006. The Complete Mitochondrial Genome Of The Mantis Shrimp  H.Harpax, and A Phylogenetic Investigation of The Decapoda Using Mitochondrial Sequences. Mol Phylogenet Evol 38: 565–574.

Moosa, M. 1997. Stomatopoda sebagai Salah Satu Potensi Sumberdaya Hayati Laut. Perwata Oseana 5: 1-6.

Kumar S, Dudley J, Nei M, Tamura K. 2008. MEGA: A Biologist-Centric Software for Evolutionary

Analysis of DNA and Protein Sequences. Briefings in Bioinformatics 9: 299-306.

Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in natural populations: an improve routine for the screening

of genetic variation based on sensitive silver staining. Elecytrophoresis 7:226-229.

 

No Comment

Comments are closed.