Seminar Evi Alfiah Taukhid G34062381

Evi Alfiah Taukhid, Achmad Farajallah dan Arif Wibowo. 2011. Karakterisasi Genom Mitokondria Gen Cyt b pada Ikan Belida Anggota Famili Notopteridae. Diseminarkan tanggal 2011. Departemen Biologi FMIPA IPB

 

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ikan belida merupakan ikan tawar anggota genus Chitala, Famili Notopteridae. Ikan belida atau yang dikenal sebagai ikan pipih mempunyai bentuk pipih dengan mulut lebar dan kepala kecil. Penyebaran alami ikan ini adalah di Sumatera, Jawa, dan Kalimantan sampai ke semenanjung Malaysia dan Thailand (Permatsari 2009). Di Sumatera Selatan, ikan belida digunakan sebagai maskot yang sering dijadikan bahan pembuatan makanan khas. Hal ini karena daging ikan belida berserat lembut, renyah, dan tidak amis. Selain sebagai bahan makanan, ikan belida sering kali dijadikan sebagai ikan hias karena mempunyai bentuk kepala dan variasi warna yang menarik, dan juga mudah dipelihara (Wibowo et al. 2006).

Pada saat ini, diduga populasi ikan belida di alam kondisinya menurun akibat kerusakan habitat dan pemanenan berlebih. Conservation Assessment and Management Plan (CAMP) mengkategorikan Chitala sp. sebagai spesies langka (Sarkar et al. 2008). Sebagai salah satu penggerak ekonomi masyarakat yang berbasis sumber daya alam, maka berbagai upaya untuk mempelajari populasinya harus dilakukan. Salah satu upaya yang bisa dilakukan adalah dengan melakukan karakterisasi genom mitokondria sebagai dasar aplikasi lanjutan yang terkait dengan populasi belida.

Genom mitokondria vertebrata berbentuk sirkular yang terdiri dari 13 gen penyandi protein, 2 gen penyandi rRNA, 22 gen penyandi tRNA, dan satu ruas tidak menyandikan yang dikenal sebagai d-loop atau ruas pengontrol (control region). Selain itu, genom mitokondria bersifat non-rekombinasi atau diwariskan secara uniparental. Beberapa gen genom mitokondria seringkali digunakan untuk mempelajari berbagai fenomena populasi, baik intraspesies maupun interspesies (Solihin 1994).

 

Tujuan

Tujuan penelitian ini adalah menganalisis runutan nukleotida gen cyt b dalam genom mitokondria ikan belida sebagai dasar mempelajari populasi dan posisi filogenetiknya.

 

BAHAN DAN METODE

Bahan

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 12 sampel darah dan/atau sirip ikan belida yang diambil dari Sungai Mahakam Kalimantan dan Indragiri Riau. Sampel tersebut merupakan koleksi Bapak Arif Wibowo SP. M.Si dari Balai Riset Perikanan Perairan Umum, Palembang.

 

Ekstraksi dan Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dari darah dan/atau sirip dilakukan menggunakan Genomic DNA mini kit for fresh blood (Geneaid) yang dimodifikasi. Modifikasi dilakukan untuk melisis sel-sel darah dan jaringan yang sudah diawetkan dalam alkohol. Sel-sel darah yang disimpan dalam alkohol 70% dicuci dengan air destilata dua kali kemudian disuspensikan dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8.0) hingga volume 350µl. Sedangkan potongan sirip dihancurkan menggunakan gunting dalam bufer STE. Sel-sel darah dan sirip dilisis dengan SDS 1% dan proteinase K 0.125 mg/ml pada suhu 55oC selama 1 jam sambil dikocok pelan. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNA mini kit for fresh blood (Geneaid).

 

Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA

Amplifikasi gen cyt b genom mitokondria menggunakan pasangan primer W8 dan W7 berdasarkan Lavoue´ S dan Sullivana  (2004). Pasangan primer ini mengapit ruas gen cyt b mulai dari basa ke-14359 hingga 15594 dengan panjang 1236 nt dibandingkan ke genom mitokondria Chitala lopis (GeneBank Accession number AP008922). Komposisi reaksi PCR dilakukan dengan volume akhir 50 µl terdiri atas sampel DNA 5 µl, DW steril 16 µl, primer masing-masing 2 µl dan Taq ready mix 25 µl. Reaksi PCR dilakukan menggunakan mesin thermocycler BIOER dengan kondisi tahap pradenaturasi 95°C selama 10 menit, tahap berikutnya terdiri dari 35 siklus dari denaturasi 94°C selama satu menit, penempelan primer 42°C selama satu menit dan pemanjangan 72°C selama 1.5 menit. Dan tahap terakhir adalah pemanjangan akhir 72°C selama 7 menit.

Produk PCR diuji menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstorm 1986).

Perunutan Produk PCR

Produk  PCR di atas gel poliakrilamid yang berukuran sesuai dengan desain primer dipilih untuk dimurnikan dengan metode agarose-gel-cutting yang diikuti dengan spin-coloumn DNA extaraction from gel. Produk PCR yang sudah dimurnikan dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing menggunakan pasangan primer yang sama dengan ampilfikasi awal.

 

Analisis DNA

Hasil perunutan nukleotida yang diperoleh kemudian diedit secara manual berdasarkan kromatogram mesin perunut DNA. Runutan nukleotida yang telah diedit kemudian saling disejajarkan menggunakan program Clustal W yang tertanam dalam MEGA 4.0  (Kumar et al. 2008) dengan melibatkan beberapa runutan gen cyt b anggota famili Notopteridae, yaitu Chitala lopis (AP008922) dan Notopterus notopterus (AP008924). Hasil pensejajaran kemudian diedit ulang secara manual berdasarkan triplet kodon.

Deskripsi perbandingan runutan nukelotida dan analisis filogeni dilakukan menggunakan MEGA 4.0 (Kumar et al. 2008) berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter. Analisis kekerabatan antar sampel menggunakan metode neighbour joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.

 

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA

Amplifikasi gen cyt b dengan menggunakan pasangan primer W8-W7 selalu menghasilkan amplikon yang tidak spesifik (unspecific PCR products). Hal ini disebabkan oleh spesifisitas penempelan primer berkisar antara 66% – 86% terhadap runutan nukleotida genom mitokondria pada beberapa spesies pembanding. Multiband amplicon ini mungkin disebabkan oleh spesifisitas primer yang rendah terhadap runutan mtDNA genus Notopterus. Walaupun begitu, ukuran amplikon yang sesuai dengan desain primer kemudian dipotong setelah dipisahkan menggunakan metode gel extraction-spin coloumn.

Dari 12 sampel, ada tujuh sampel (KCO001, KCO005, TU02, TU06, TU07, PP03, dan KALTIM02) yang menunjukkan adanya amplikon target ukuran, yaitu dengan ukuran sekitar 1200 bp. Lima sampel sisanya (PB34, PB02, KCO02, TP04, dan KALBAR03) tidak menghasilkan amplikon yang sesuai dengan target ukuran atau intensitas amplikon yang muncul di atas gel poliakrilamid terlalu tipis.

 

Perunutan Produk PCR

Perunutan nukleotida pada enam sampel yang berasal dari dua lokasi, yaitu KCO001 dan KCO005 dari Sungai Indragiri, Riau; TU02, TU06, TU07, dan KALTIM02 dari Sungai Mahakam, Kalimantan menunjukkan homologi yang tinggi dengan spesies pembanding. Sedangkan satu sampel (PP03) tidak menghasilkan kromatogram runutan DNA yang baik. Setelah diedit, panjang runutan DNA yang saling homolog untuk setiap sampel adalah 650 nt dan diperoleh rata-rata komposisi nukleotida dari enam sampel tersebut ialah A = 30.7%; T = 25.9%; G = 12.8%; C = 30.5%. Dari 650 nt, sebanyak 497 nt sama pada semua sampel. Sedangkan dari 153 nt yang berbeda, terdiri dari 102 nt mengalami substitusi hanya pada satu sampel, dan 51 nt berbeda minimal pada dua sampel.

 

Analisis Filogeni

Jarak genetik antar populasi lokal spesies yang diperoleh dari Sungai Mahakam dan Indragiri yang dibandingkan dengan spesies lainnya yang diperoleh dari genebank biasanya ditentukan untuk populasi hewan tertentu pada daerah geografi yang terpisah. Dua hal yang diperlukan dalam menentukan jarak genetik adalah kesamaan genetik dan nilai jarak genetik. Jarak genetik antar sampel dibandingkan dengan sampel spesies yang telah ada di genebank beserta standar error yang diperoleh berdasarkan model subtitusi K2P dengan bootstrap 1000x (Tabel) menghasilkan nilai rata-rata sebesar 0.089 dengan kesamaan genetik tertinggi sebesar 0.168 pada Notopterus notopterus (India) dengan KCO001, serta jarak genetik terendah sebesar 0.000 pada TU02 dengan KALTIM02.

Tabel.  Jarak genetik antar sampel (di bawah diagonal) dan standar error (di atas diagonal)  berdasarkan model subtitusi K2P dengan bootstrap 1000x.

No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8
1 KALTIM02 0.014 0.009 0.000 0.002 0.004 0.014 0.015
2 KCO001 0.105 0.014 0.014 0.014 0.015 0.015 0.018
3 KCO005 0.045 0.112 0.009 0.009 0.009 0.014 0.016
4 TU02 0.000 0.105 0.045 0.002 0.004 0.014 0.015
5 TU06 0.002 0.107 0.047 0.002 0.004 0.014 0.015
6 TU07 0.009 0.116 0.053 0.009 0.011 0.015 0.016
7 C. lopis 0.109 0.116 0.113 0.109 0.111 0.114 0.017
8 Notopterus (India) 0.139 0.168 0.143 0.139 0.141 0.151 0.161

 

Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x, mengelompokkan struktur populasi yang digambarkan oleh mtDNA ini setidaknya membagi populasi ikan belida yang berasal dari Sungai Mahakam dan Indragiri serta spesies lain yang berasal dari genebank menjadi dua kelompok (Gambar 2). Kelompok I terdiri dari semua sampel (KALTIM02, TU02, TU06, TU07, KCO001, dan KCO005), serta satu spesies dari genebank, yaitu C. lopis. Kelompok II adalah Notopterus notopterus (India). Titik nenek moyang (anchestral node) menunjukkan bahwa kekerabatan keenam sampel berasal dari satu nenek moyang/indukkan dengan C. lopis, dengan nilai keragaman 1%. Hal ini disebabkan oleh pola penyebaran ikan belida sangat berkaitan erat dengan arus. Sebagai predator air tawar, ikan belida hidup di habitat sungai dan daerah yang sering tergenang banjir. Hidupnya di dataran rendah dengan ketinggian tidak lebih dari 30 mdpl (Widyastuti 1993). Ditegaskan pula oleh Sjafei et al. (1989) bahwa ikan ini merupakan contoh ikan yang berdistribusi di dataran rendah. Faktor-faktor yang mempengaruhi distribusi ikan air tawar adalah faktor fisik yang meliputi suhu, derajat fluktuasi air, gradien, urutan aliran, dan turbiditas; faktor kimia yang meliputi oksigen terlarut, pH, senyawa nitrogen, klorinitas, salinitas, dan BOD; serta faktor biologi yang meliputi hubungan predator dan mangsa, kompetisi, dan simbiosis.

Gambar  1.  Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokkan enam sampel dan dua spesies  dari genebank.

 

SIMPULAN DAN SARAN

Keragaman genetik dan hubungan filogeni berdasarkan gen cyt b mtDNA pada enam sampel yang berasal dari Sungai Mahakam, Kalimantan dan Indragiri, Riau yang dibandingkan dengan dua sampel dari genebank, berada dalam kelompok yang sama dengan cyt b mtDNA dari Chitala lopis.

Dibutuhkan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan ruas gen pada mtDNA selain gen cyt b dan pengambilan sampel dari berbagai populasi yang berbeda dari Sungai Mahakam dan Indragiri untuk membuktikan kekerabatan antara sampel dengan C. lopis

 

DAFTAR PUSTAKA

Kumar S, Dudley J, Nei M, Tamura K. 2008. MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in Bioinformatics 9:299-306.

Lavoue´ S, Sullivana JP. 2004. Simultaneous analysis of five molecular markers provides a well-supported phylogenetic hypothesis for the living bony-tongue fishes (Osteoglossomorpha: Teleostei). Molecular Phylogenetics and Evolution 33 (2004) 171–185.

Permatsari HP. 2009. Fauna identitas ikan belida. http://indopedia.gunadarma.ac.id/content/88/5942/id/ikan-belida-notopterus-chitala-hb.html [9 September 2010].

Sarkar UK, Negi RS, Deepak PK, LakraWS, Paul SK. 2008. Biological parameters of the endangered fish Chitala chitala (Osteoglossiformes: Notopteridae) from some Indian rivers. Fisheries Research 90 (2008) 170–177.

Sjafei S, Rahardjo MF, Affandi R, Brodjo M. 1989. Sistematika Ikan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat, Institut Pertanian Bogor.

Solihin DD. 1994. Peran DNA mitokondria (mtDNA) dalam studi keragaman genetik dan biologi populasi pada hewan. J Hayati 1:1-4.

Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in natural populations: an improve routine for the

screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Elecytrophoresis 7:226-229.

Wibowo A, Sunarno MTD, Makmur S, Subagja, Muflikhah N. 2006. Ikan Belida (Chitala lopis) Potensinya Sebagai Ikan Hias Unggulan dan Berbagai Hambatan Pengembangannya. Palembang: Balai Riset Perikanan Perairan Umum.

Widyastuti YE. 1993. Flora-Fauna Maskot Nasional dan Propinsi. Penebar Swadaya: Jakarta.

 

No Comment

Comments are closed.