Seminar Raisa Auliane Syafrina

Raisa Auliane Syafrina, Achmad Farajallah, dan Yusli Wardiatno.  2011. Pengembangan DNA Barcode untuk  Konservasi Populasi Udang Mantis. Seminar disampaikan Tanggal 15 Agustus 2011, Departemen Biologi FMIPA IPB

 

 

 

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Barcode DNA sebagai  ide ilmiah telah menarik perhatian dunia sebagai sistem terbaru membuktikan identifikasi spesies secara cepat dan akurat menggunakan urutan pendek DNA (Meier et al. 2006). Ruas DNA yang bisa digunakan untuk sistem tersebut harus terstandardisasi sebagai label suatu spesies. Barcode DNA juga menjadi salah satu alternatif pengganti dari identifikasi taksonomi kovensional yang kurang praktis (Lahaye et al. 2008). Barcode DNA menjanjikan beberapa manfaat, antara lain mengenali spesies, memastikan keamanan pangan, memastikan keberadaan dan atau spesies larva, mengontrol hama pertanian, dan melacak asal usul  vektor penyakit dan serangan hama pada suatu area.

Teknologi barcoding menggunakan penanda gen sitokrom oksidase sub unit 1 (CO1) dalam genom  mitokondria (mtDNA) dapat mengidentifikasi hampir semua spesies hewan (Ward et al. 2005), baik interspesifik maupun intraspesifik (Hebert et al. 2003). Pada hewan, penggunaan mtDNA dalam analisis biogeografi dan sistematik sering tidak sejalan dengan morfologi.  Salah satu penyebabnya adalah karakter morfologi seringkali memperlihatkan fenomena species cryptic. Sedangkan mtDNA hewan merupakan genom sitoplasmik yang diwariskan secara uniparental dan tidak mengalami rekombinasi sehingga species sibling bisa dipastikan mempunyai mtDNA dengan nilai kesamaan yang tinggi.  Salah satu ruas mtDNA yang banyak digunakan sebagai barcode adalah cytochrome oxidase 1 (CO1) yang dipopulerkan oleh Hebert et al. (2003). Gen cytochrome oxidase 1 (CO1) adalah segmen dari DNA mitokondria yang terdiri atas 648pb.

Udang mantis atau yang dikenal dengan udang ronggeng merupakan anggota  krustasea, Ordo Stomatopoda, yang menyebar dalam empat famili, yaitu Odontodactylidae, Lysiosquillidae, Harpiosquillidae dan Squilidae. Beberapa spesies udang mantis, terutama yang bisa mencapai ukuran >30 cm, biasa dijadikan sebagi makanan eksotis dan komoditi ekspor dengan harga yang relatif mahal (Ahyong et al. 2008). Kelompok udang ini dicirikan dengan  tubuh yang bersegmen, di belakang kepala terdapat karapas pendek, kaki  beruas-ruas, ukuran tubuh yang besar dan mata seringkali berbentuk T (Carpenter & Niem 1998). Beberapa udang mantis yang bernilai ekonomi tinggi adalah dari famili Harpiosquillidae dan Squilidae. Kedua famili tersebut biasa ditangkap dari Laut Jawa dan Laut Cina Selatan sampai ke sisi utara Kalimantan. Pergerakan arus menyebabkan pola penyebaran mengikuti garis pantai (Barber et al. 2002).  Selain itu, dari 450 spesies yang telah dideskripsikan, 118 (26%) diantaranya bisa ditemukan di perairan Indonesia (Ahyong et al. 2008, Moosa 2000). Jumlah spesies udang mantis yang sangat tinggi di Indonesia (jika dibandingkan dengan laut Brazilia dengan 35 spesies dan laut Mediterania 10 spesies)  tidak sejalan dengan keterkenalannya sebagai bagian dari kekayaan biodiversitas Indonesia. Oleh karena itu, dalam penelitian ini dikembangkan teknik DNA barcode untuk meningkatkan pengetahuan tentang identifikasi spesies udang mantis yang terdapat di perairan Indonesia. Dengan begitu, aplikasi DNA barcoding dapat digunakan untuk melacak asal-usul suatu komoditas laut.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan teknik DNA barcoding untuk konservasi populasi udang mantis.

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari-Juni 2011. Analisis DNA  dilakukan di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

BAHAN DAN METODE

Bahan

Spesies udang mantis merupakan koleksi Dr. Yusli Wardiatno dari Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan IPB yang dipreservasi dalam etanol.

Metode

Identifikasi sampel. Identifikasi spesies udang mantis dilakukan menggunakan kunci identifikasi  Manning (1980).

Ekstraksi DNA. Sampel jaringan sebagai sumber DNA adalah otot tungkai. Ekstraksi dan isolasi DNA menggunakan DNA Extraction Kit for Fresh Blood (Geneaid) yang dimodifikasi untuk sampel jaringan yang diawetkan dalam alkohol. Otot tungkai yang disimpan dalam etanol dicuci dengan air destilata dua kali kemudian dihomogenasi dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8). Pemberian air destilata dilakukan untuk mencuci alkohol sebagai pengawet sampel agar tidak mengganggu proses-proses berikutnya. Sel-sel otot dilisis menggunakan proteinase K 0,125 mg/ml dan sodium dodesil sulfat 1%. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk kit ekstraksi DNA. Genomic DNA mini kit for fresh blood

Amplifikasi DNA. Amplifikasi ruas gen CO1 mtDNA dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) menggunakan primer  forward AF286 (5’-TCTACAAAYCATAAAGAYATYGG-3’) atau forward AF215 (5’-TTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) dan reverse AF287 (5’-GTGGCRGANGTRAARTARGC TCG-3’). Primer tersebut memiliki ukuran produk sekitar 800 pb. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 50 μL menggunakan mesin thermocycler BIOER.  Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan 30 siklus yang terdiri atas denaturasi suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer suhu 55oC selama 1, 5 menit, pemanjangan 72oC selama 2 menit dan diakhiri pemanjangan akhir suhu 72oC selama 5 menit. Penyajian produk PCR dilakukan menggunakan metode polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dijalankan pada tegangan 200 V selama 50 menit yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Byun et al. 2009).

DNA Sequencing. PCR for sequencing dilakukan oleh perusahaan jasa pelayanan sekuens. PCR untuk sekuens menggunakan DNA hasil amplifikasi dan primer  yang sama seperti amplifikasi awal.

Analisis Filogeni. Runutan nukleotida yang diperoleh diedit secara manual berdasarkan kromatogram menggunakan software BioEdit Sequence Alignment Editor 6.32 dan Genetyx Vs 4.01. Runutan-runutan nukleotida yang telah diedit saling disejajarkan antar mereka menggunakan program Clustal X dan saling disejajarkan dengan dengan runutan nukleotida referensi  dari GeneBank. Runutan nukleotida referensi ini diperoleh setelah hasil sekuensing dijadikan input dalam BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang tertanam dalam GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ). Analisis keragam nukleotida dan analisis filogenetik dilakukan menggunakan program MEGA version 4 (Tamura et al. 2007).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Amplifikasi dan Visualisasi DNA

Gen CO1 yang menjadi target  diamplifikasi menggunakan pasangan primer AF286-AF287 dan AF215-AF287 berukuran sekitar 700-800 bp, dengan jumlah sampel sebanyak 34 buah pada setiap pasangan primer. Pada beberapa sampel suhu optimum penempelan primer pada saat amplifikasi yaitu 55°C.. Pita DNA target berhasil ditemukan dari pasangan primer 286-AF287 sebanyak 12 sampel, sedangkan dari pasangan primer AF215-AF287 sebanyak 14 sampel. Dari total sampel yang berhasil menampakkan pita DNA target, hanya 9 sampel dari setiap pasangan primer yang dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing karena beberapa pita DNA muncul tipis pada gel poliakrilamid saat proses visualisasi. Setelah DNA target dimurnikan dan dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing, maka diperoleh 10 sampel yang terbaca dengan jelas pada kromatogram.

Analisis DNA dan Filogeni

Dari total 18 sampel yang dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing, hanya 10 sampel yang dapat terbaca dengan jelas pada kromatogram. Hal tersebut dapat disebabkan karena Primer yang dipakai adalah primer degenerate, yaitu campuran primer yang berbeda pada 1 atau 2 basa, tetapi mempunyai panjang atau jumlah nukleotida yang sama. Sehingga primer bisa menempel lebih dari 1 ruas basa. Visualisasi pita DNA menunjukkan multiband pada gel. Kejadian tersebut bisa terjadi karena beberapa alasan, antara lain primer yang digunakan kurang spesifik untuk gen CO1 pada mtDNA, gen CO1 dilaporkan juga ada di dalam genom inti, dan primer yang digunakan mempunyai penempelan >70% pada bagian awal gen CO1 dari kelompok bakteria.

Tabel 1 Jumlah perbedaan nukleotida gen CO1 antar spesies udang mantis

Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 1Hstephensoni
2 2Hstephensoni 2
3 Hharpax 3 1
4 Hglyptocercus 86 88 87
5 Smantis 78 78 79 98
6 22Cmultcarinatai 89 91 90 95 96
7 9Cmulticarinata 114 114 113 98 104 85
8 11Cmulticarinata 113 113 112 96 103 83 2
9 37Hharpax 86 86 85 102 97 95 106 104

 

Sampel dengan nilai perbedaan paling kecil menunjukkan tingkat kesamaan yang tinggi, sehingga sampel nomer 2 yang diduga sebagai Harpiosquilla stephensoni memiliki kesamaan yang tinggi dengan Harpiosquilla harpax dari genebank. Sampel dengan tingkat kesamaan yang rendah terdapat pada sampel nomer 9 yang diduga sebagai Carinosquilla multicarinata dengan sampel nomer 1 Harpiosquilla stephensoni.

Hasil percobaan membuktikan bahwa spesies yang awalnya diidentifikasi berdasarkan pada morfologi saja masih mungkin terdapat kesalahan. Pengembangan pustaka barcode dapat dijadikan suatu cara identifikasi sampai tingkat spesies dengan tingkat kebenaran yang tinggi.

Tabel 2 Jarak genetik gen CO1 antar spesies udang mantis berdasarkan model subtitusi K2P

Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 1Hstephensoni
2 2Hstephensoni 0.003
3 Hharpax 0.005 0.002
4 Hglyptocercus 0.164 0.168 0.166
5 Smantis 0.147 0.147 0.149 0.191
6 22Cmultcarinatai 0.170 0.175 0.172 0.184 0.187
7 9Cmulticarinata 0.229 0.229 0.226 0.192 0.205 0.163
8 11Cmulticarinata 0.227 0.227 0.224 0.187 0.203 0.158 0.003
9 37Hharpax 0.164 0.164 0.162 0.200 0.188 0.184 0.211 0.206

 

Jarak genetik antar sampel dibandingkan dengan sampel spesies yang ada di GeneBank berdasarkan basa pertama dan kedua dengan model substitusi K2P (Tabel 2) menghasilkan jarak genetik tertinggi sebesar 0.229 (22.9%) ditemukan antara sampel nomer 9 dengan sampel nomer 1. Jarak genetik terendah sebesar 0.002 (0.2%) antara sampel nomer H. harpax dengan sampel nomer 2.

Gambar 1 Hasil rekonstruksi pohon filogeografi pengelompokan sampel berdasarkan ruas CO1 mtDNA  menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x

 

Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootstrap1000x mengelompokkan sampel 9, 11, dan 22 berada di luar percabangan. Struktur populasi yang digambarkan oleh mtDNA ini menunjukkan bahwa kekerabatan sampel 1, 2, dan 37 adalah berasal dari satu nenek moyang/indukkan. Sedangkan populasi sampel 9, 11, dan 22 berbeda nenek moyang/indukan.

KESIMPULAN

Sampel yang diduga sebagai H. stephensoni memiliki kesamaan yang tinggi dengan H. harpax dari geneBank, serta memiliki jarak genetik terkecil yaitu 0,2%. DNA barcode sebagai alat identifikasi mampu memberikan kepastian spesies udang mantis.

DAFTAR PUSTAKA

Ahyong S, Chan T, dan Liao Y. 2008. A Catalog of The Mantis Shrimps (Stomatopoda) of Taiwan. Taiwan: National Taiwan Ocean University.

Barber P, Moosa MK, dan Palumbi SR. 2002. Rapid Recovery of Genetics Diversity of Stomatopod Populations on Krakatau: Temporal and Spatial Scales of Marine Larval Dispersal. Journal of The Royal Society 269: 1591-1597.

Byun SO, Fang Q, Zhou H, dan Hickford JGH. 2009. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem 385: 174-175.

Carpenter KE dan Niem VH. 1998. The Living Marine Resources of The Western Central Pacific Volume 2: Cephalopods, Crustacean, Holothurians and Shark. Rome: Food and Agriculture Organization of The United Nation.

Hebert PDN, Ratnasingham S, dan De Waard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc 270: 96–99.

Lahaye et al. 2008. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots. PNAS 105(8): 2923-2928.

Manning RB. 1980. The superfamilies, families and genera of recent stomatopod Crustacea with diagnoses of six new families. Proc Biol  Soc Wash 93: 362-372.

Meier R, Shiyang K, Vaidya G, dan Peter. 2006. DNA barcoding and taxonomy in diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success. Systematic Biology 55(5): 715-728.

Moosa M. 2000. Marine biodiversity of the South China Sea a checklist of stomatopod Crustacea. The Raffles Billetin of Zoology 8: 405-457.

Tamura K, Dudley J, Nei M dan Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599.

Ward RD, Zemlak TS, Innes B, dan Last P. 2005. DNA Barcoding Australia’s fish species. Philosophical Transactions of The Royal Society 360: 1847-1857.

 

2 Comments so far

  1. naura on March 20th, 2012

    mas faraja,
    saya naura, mahasiswa kimia dr ITS Sby, sy lh ngerjain TA mas, dan sedang butuh info ttg perusahaan pelayanan jasa sequencing..
    kalo boleh tau, mas faraja sequencing DNAnya dimana ya, boleh ndak saya minta contact person atau email yg bs dihubungi begitu..
    makasih mas faraja…^_^

  2. lia.undip on June 2nd, 2012

    hai, sy lia dari magister ilmu kelautan undip. saya ada sedikit pertanyaan mengenai autotomy method, mohon informasinya ttg istilah itu terutama untuk crustacea ataupun crab